Resident Evil Zero é um videogame de terror de sobrevivência em terceira pessoa e uma prequela do primeiro Resident Evil. A jogabilidade permanece praticamente a mesma dos jogos anteriores da série, mas também introduz o que chama de sistema de zapping de parceiros, que permite alternar entre os dois personagens Rebecca e Billy a qualquer momento. Esse recurso deve ser usado às vezes, pois o jogo exige que os dois personagens trabalhem juntos para resolver alguns quebra-cabeças. Novos no jogo são um monte de inimigos aterrorizantes, como a centopeia mutante, novas áreas para explorar e a capacidade de soltar itens no chão em vez de ter que encontrar uma caixa de itens.

Em 23 de julho de 1998, a equipe especial de ESTRELAS da polícia Bravo é enviada para investigar uma série de assassinatos terríveis na região das Montanhas Arklay, fora de Raccoon City. No caminho para o local, o helicóptero de Bravo falha e é forçado a pousar na floresta. A equipe logo descobre um caminhão de transporte da polícia militar derrubado, junto com os cadáveres mutilados de dois oficiais. A equipe se separou e a médica de campo da equipe Bravo, Rebecca Chambers, encontra um trem parado no meio da floresta. Rebecca logo descobre que o trem, o Expresso Eclíptico, está infestado de zumbis.