Mario Super Sluggers, a sequência de Mario Superstar Baseball, continua a jogabilidade estilo arcade dos jogos esportivos Mario. Mario e seus amigos são convidados para o Reino do Beisebol para jogar uns contra os outros. Quando Bowser ouve isso, ele imediatamente interrompe o grupo. Existem vários modos de jogo para escolher, como no jogo anterior. No modo de Exibição, os jogadores jogam um único jogo uns contra os outros. Os jogadores podem escolher diferentes opções, como quantos turnos jogar, se os capitães podem usar poderes de estrela (cada capitão tem um balanço de estrela e arremesso diferentes) e alternar itens de erro para fora e para cima (itens de erro podem ser jogados em jogadores de campo). O modo Desafio para um jogador é diferente desta vez. Em vez de escolher um capitão de equipe, os jogadores começam com Mario, que deve encontrar companheiros para enfrentar Bowser Jr. e Bowser. Os colegas de equipe não são desbloqueados jogando um jogo, eles só se juntam à equipe limpando certos objetivos. A maior parte da ação ocorre em áreas com uma perspectiva aérea; cada área é baseada em torno de um capitão de equipe. Cada capitão tem uma habilidade especial de encontrar companheiros de equipe e moedas, que são usadas para comprar itens para ajudar na missão ou em um jogo contra Bowser Jr. ou mais tarde contra Bowser. Mais moedas podem ser obtidas em minijogos. O modo Toy Field é ligeiramente diferente do apresentado em Mario Superstar Baseball. Como no jogo GameCube, os jogadores se revezam para ganhar pontos; um turno é concedido a quem agarra e segura a bola após um certo período de tempo. Ao contrário do jogo anterior, no entanto, os jogadores de campo podem atacar uns aos outros para roubar a bola de quem a tiver. O batedor também pode jogar itens nos campistas para fazê-los largar a bola e conceder ao batedor outro turno.

A história se passa no modo desafio do jogo. Mario e seus amigos viajam para o Reino do Beisebol para relaxar e jogar um pouco de beisebol, quando Bowser Jr. aparece de repente e joga a ilha no caos. Mario deve viajar pela ilha e por cada uma das áreas únicas e especializadas, a fim de recrutar diferentes personagens e capitães para desafiar Bowser Jr. para um jogo de beisebol. Once Bowser Jr. foi derrotado, ele recua, mas então Bowser parece desafiar a equipe de Mario e assumir a ilha. Ao derrotar Bowser, a equipe de Mario comemora e dá uma grande festa. Bowser e Jr. são convidados para a festa também e Bowser acaba salvando Mario de um dos truques de Wario e Waluigi.