O DJ Hero simula principalmente o turntablism, um estilo musical usado por disc jockeys para criar uma nova música de mashup, incorporando uma ou mais músicas gravadas anteriormente tocadas em toca-discos, juntamente com geradores de efeitos sonoros. O jogo apresenta uma jogabilidade de ataque de pontuação semelhante aos jogos Guitar Hero. O controlador consiste em um deck sem fio que consiste em uma plataforma giratória móvel que suporta 3 botões "stream", um mostrador de efeitos, um crossfader e um botão "Euphoria"; um painel oculto contém botões de controle adicionais para interagir com o console de jogos fora do jogo. Uma parte do controlador pode ser destacada e recolocada para adaptar a unidade para jogadores canhotos. As notas viajam em um arco através de uma gravação giratória na tela, e o jogador mantém pressionado um dos 3 botões de transmissão para tocar as notas; dois botões refletem as duas músicas usadas nessa mistura específica e o terceiro representa amostras para adicionar à mistura que podem ser ajustadas com o seletor de efeitos. O jogador também deve ajustar constantemente o crossfader para corresponder aos símbolos na tela, o que altera o volume relativo das músicas para trazer uma música para a frente da mixagem por um curto período de tempo. Certas faixas são mostradas na tela como uma série de setas para cima ou para baixo, representando seções de arranhões, exigindo que o jogador gire a plataforma giratória na direção das setas enquanto mantém pressionado o botão para marcar pontos, imitando o arranhão da agulha de gravação em álbuns de vinil. "Euphoria" é equivalente ao Star Power do Guitar Hero, coletado ao completar com sucesso frases específicas na mixagem de músicas, chamadas Regiões Perfeitas, e pode ser lançado pressionando o botão Euphoria, dobrando o multiplicador atual do jogador, bem como o crossfading automático quando ativo. Há também um medidor "Rebobinar" que é construído através de uma reprodução consistente e bem-sucedida e, uma vez cheio, permite que o jogador rebobine a música para corrigir erros em seu desempenho. O reprodutor deve continuar a ter um bom desempenho ou seu medidor de desempenho cairá e a faixa de música será cortada. Não é possível falhar na música, ao contrário dos jogos Guitar Hero. Um modo carreira para um jogador está disponível, bem como modos multijogador competitivos e cooperativos ("DJ vs DJ"), jogáveis localmente ou remotamente. Dez músicas foram especialmente mixadas para também suportar a jogabilidade com Guitar Hero e outros controladores de guitarra compatíveis em um modo "DJ vs Guitar". Os jogadores também podem usar um microfone para uma adição sem pontuação à mistura. Um modo Party Play permite que o jogo reproduza automaticamente as músicas com a capacidade de um jogador entrar e jogar a qualquer momento.