The Binding of Isaac é um jogo de tiro de RPG de ação gerado aleatoriamente com elementos pesados e desonestos. Seguindo Isaac em sua jornada, os jogadores encontrarão tesouros bizarros que mudam a forma de Isaac, dando-lhe habilidades super-humanas e permitindo-lhe lutar contra multidões de criaturas misteriosas, descobrir segredos e lutar contra seu caminho para a segurança.

A trama de The Binding of Isaac é vagamente inspirada na história bíblica de mesmo nome. Isaac, uma criança, e sua mãe moram em uma pequena casa em uma colina, ambos felizes em ficar sozinhos, com Isaac fazendo desenhos e brincando com seus brinquedos, e sua mãe assistindo a transmissões cristãs na televisão. A mãe de Isaque então ouve "uma voz do alto", afirmando que seu filho está corrompido pelo pecado e precisa ser salvo. Ele pede que ela remova tudo o que era mau de Isaque, na tentativa de salvá-lo. Sua mãe obedece, tirando seus brinquedos, desenhos e até mesmo suas roupas. A voz mais uma vez fala com a mãe de Isaque, afirmando que Isaque deve ser cortado de tudo o que é mau no mundo. Mais uma vez, sua mãe obedece e tranca Isaac dentro de seu quarto. Mais uma vez, a voz fala com a mãe de Isaac. Afirma que ela se saiu bem, mas ainda questiona sua devoção e pede que ela sacrifique seu filho. Ela obedece, pegando uma faca de açougueiro da cozinha e caminhando até o quarto de Isaac. Isaac, observando através de uma rachadura considerável em sua porta, começa a entrar em pânico. Ele encontra um alçapão escondido debaixo do tapete e entra, pouco antes de sua mãe abrir a porta do quarto. Isaac então coloca o papel que estava desenhando em sua parede, que se torna a tela de título. Durante os pontos de carregamento do jogo, Isaac é mostrado enrolado em uma bola, chorando. Seus pensamentos são visíveis, variando entre a rejeição de sua mãe e a humilhação de seus pares para um cenário envolvendo sua própria morte. O jogo apresenta 13 finais, um após cada grande luta contra um chefe.