Luigi embarca em férias de sonho com Mario e amigos ao receber um convite para um hotel de luxo. No entanto, seu sonho rapidamente se torna um pesadelo quando o Rei Boo revela que tudo foi uma manobra para capturar Mario e seus amigos. Com a colaboração do Professor E. Gadd mais uma vez, o relutante e covarde herói Luigi atravessa os andares traiçoeiros do agora ameaçador hotel em uma missão para salvá-los.

Luigi, Mario, a Princesa Peach e um grupo de Sapos aceitam um convite para férias no The Last Resort, um grande hotel Art Déco localizado em uma remota área montanhosa. Pouco depois de chegar e se acomodar para a noite, Luigi acorda e encontra o hotel transformado em um prédio assombrado e seus companheiros desaparecidos. Ele descobre que a proprietária fantasmagórica do hotel, Hellen Gravely, orquestrou todo o convite como uma armadilha em nome do Rei Boo, a quem ela libertou do cativeiro. O rei Boo revela seu plano de aprisionar Luigi e seus amigos em retratos como vingança por suas derrotas anteriores. Luigi escapa por pouco para o porão, onde encontra o equipamento do professor E. Gadd e liberta o professor capturado. Juntos, eles descobrem que os amigos de Luigi estão sendo mantidos em algum lugar nos andares superiores do hotel. Armado com um novo dispositivo de vácuo Poltergust e auxiliado por Gooigi, uma duplicata ectoplasmática de si mesmo, Luigi deve subir pelos muitos andares temáticos do hotel, recuperando botões de elevador roubados de fantasmas poderosos para alcançar seus companheiros presos antes que o plano do Rei Boo seja bem-sucedido.